گین طول ریشه معنیدار بود. تیمارAzospirillum بدون هورمون دارای بیشترین طول ریشه بود و اختلاف معنی دار با دیگر تیمارها داشت. اثر اصلی باکتری بر طول ساقه و تعداد برگ معنیدار بود. مشاهده شد تلقیح ریزنمونهها با هر دو باکتری نسبت به شاهد باعث افزایش معنیدار طول متوسط شاخههای باززا شده گردید. افزایش طول ساقه در تیمارهای باکتری نسبت به شاهد در حدود 5/1 برابر بود. در مرحله سازگاری، اثرمتقابل هورمون و باکتری بر تعداد برگ، توسعه برگی و وزن خشک و اثر باکتری بر وزن تر و اثر هورمون بر کل طول ریشه و وزن خشک معنیدار بود. در کل تلقیح با باکتری تاثیرات مثبتی بر تعداد برگ، توسعه برگی، طول شاخه و طول ریشه داشت. ولی تاثیر منفی تلقیح باکتری بر وزن تر و خشک مشاهده گردید. افزایش سطح هورمون تاثیر مثبت بر طول کل طول ریشه داشت.

کلمات کلیدی: کشت بافت،lipoferrum Azospirillum، Pseudomonas fluorescent، فیتوهورمون، پپرومیا.

فصل اول
کلیات تحقیق

1-1 گیاهشناسی پپرومیا
گیاه پپرومیا (برگ قاشقی) از جنسPeperomia و خانواده Piperaceae میباشد. این جنس دارای بیش از ???? گونه مختلف از گیاهان همیشهسبز بالارونده است که اغلب آنها برگهای زیبایی دارند. گونه مذکور بومی نواحی استوایی آمریکا بوده و گیاهی است بسیار کم رشد که ارتفاع آن به حدود ? تا ?? سانتیمتر میرسد. برگهای آن بسیار زیاد و قلبی شکل میباشند که از قسمت مرکزی گیاه خارج میشوند. برگهای پپرومیا صورتی کمرنگ میباشد. گلها به رنگ سفید و به شکل گل آذین سنبله مانند و به طول ?? تا ?? سانتیمتر هستند و از اوایل بهار تا اواخر پاییز به چشم میخورند. این گیاه به نور متوسط، حرارت زیاد، خاک همیشه مرطوب، رطوبت ?? تا ?? درصد و خاک قلیایی احتیاج دارد. کود مورد نیاز این گیاه را می‌توان به میزان ? گرم در لیتر، هر دو هفته یکبار از فروردین تا مهرماه، مورد استفاده قرار داد (کریمی، 1390).

1-2 نگهداری گیاه پپرومیا
پپرومیا گیاهی است گرمسیری با برگهای چرمی شکل و قاشقی (شکل1-1)، این گیاه دارای نیاز آبی کم (بسته به شرایط محیط) میباشد، و همچنین نیاز نوری کمی دارد و سایه آپارتمان را به خوبی تحمل میکند، هم بصورت مجزا و هم در کاشت گروهی زیباست. این گیاه اگرچه رشد سریعی ندارد، ولی در هر شرایطی در آپارتمان پرورش مییابد. معمولا آنها را در تراریوم و باغ شیشهای یا مجموعهی گلهای یک سبد پرورش میدهند. با توجه به شکل ظاهری و نحوهی رشد آنها را به سه گروه تقسیم نمودهاند: گروه اول: بوتهای که دارای دمبرگهای قرمز هستند، بعضی نیز برگهای گوشتی و قلبی شکل دارند، گروه دوم: دارای ساقههای بلند و قرمز رنگ هستند و بعضی ساقههای گوشتی دارند و لبه برگها ارغوانی است و گاه سطح برگ با موهای بسیار ظریفی پوشیده شده است. گروه سوم: گروه بالارونده که به داربست یا قیم بسته میشوند و بالا میروند، با اینکه از گلدان آویزان میشوند و دارای ساقههای قرمز و بسیار ظریف نقرهای و بعضی دارای برگهای سبز آبدار هستند و بخصوص برای گلدانهای آویز بسیار مناسبند. گیاه پپرومیا یک ساقه گلدهنده با شاتونهای سبز رنگ تولید میکند که ارزش زینتی ندارد، زمانی که این گیاه به گل میرود، کیفیت برگها و زیبایی آن کمتر میشود، با حذف ساقههای گلدهنده میتوان گیاه را مرتب به حالت رویشی و نونهالی مشاهده کرد. این گیاه به سرمای زیاد مقاومت ندارد و حداکثر میتواند در زمستان 15 درجه سانتیگراد را تحمل نماید و در فصل رشد دمای 24 تا 30 درجه برای آن بسیار مناسب است. این گیاه در زیر تابش اشعه فلورسنت پژمرده میشود و نیاز چندانی به آب ندارد و همیشه مقدار زیادی آب در برگهای آن وجود دارد و سطح خاک گلدان بین دو آبیاری باید کاملا خشک شود، ولی نباید آبیاری آنقدر به تعویق افتد که برگها پژمرده شوند. در زمستان به آب ولرم نیاز دارد و مقدار آبیاری باید بسیار کمتر باشد، ریشه آن سطحی است و گسترش چندانی ندارد و در هوای آلوده، زرد و خشک میشود، در صورت آب دادن زیاد اطراف یقه ساقه، موجب پوسیدگی اطراف آن میشود. میزان رطوبت هوای لازم برای این گیاه حدود 50 درصد است، چنانچه رطوبت و حرارت و سرما از حد خود تجاوز کند، لکههایی بر سطح برگ ظاهر میشوند، برگ را بیحس میکنند و میافتد. هر دوماه یکبار سطح خاک گلدان را باید خراش داد تا هوا به داخل آن نفوذ کند و در فصل بهار گلدان را در فضای آزاد در محلی سایه قرار دهید تا حالت طبیعی خود را به دست آورد. هر اندازه قابلیت نفوذ خاک این گیاه بیشتر باشد ریشه و ساقه از پوسیدگی محفوظ خواهد بود. بهتر است برای تهیه خاک گلدان این گیاه یک قسمت پیت بعلاوه یک قسمت ماسه به همراه یک قسمت خاک باغچه استفاده شود و کف گلدان مقداری ماسه و سنگریزه بریزید، زمان مناسب برای تغییر گلدان این گیاه فصل بهار است. پپرومیای ابلق یا سفید با قلمههای بذر و ساقه تکثیر میشود و پپرومیای سبز با قلمههای برگ و ساقه تکثیر میشود. بهتر است در بهار و تابستان از قلمههای یک ساله برای گیاه استفاده نمود و برای این کار قلمه را به میزان 4 تا 5 سانتیمتر در ماسه شسته فرو برده و در محلی که دمای آن 18 درجه باشد در تاریکی قرار میدهند. در مورد انواع گوشتی آن برگ را روی سطح ماسه خوابانیده و روی آن ماسه شسته میریزند، پس از مدتی در انتهای رگبرگها ریشه ظاهر میشود (کریمی، 1390).

1-3 نقش کشت بافت در تکثیر گیاهان
تکنیک کشت بافت گیاهی نقش کلیدی در انقلاب سبز دوم دارد که در این انقلاب تغییرات ژنی و بیوتکنولوژی جهت پیشرفت کیفیت و کمیت محصولات زراعی بکار میروند. این تکنولوژی برای محدوده وسیعی از گیاهان زراعی و گونههای درختی جهت حل مشکلات بکار گرفته شده است. این روش بواسطه تلاشهای مداوم و پیگیر تعداد زیادی از دانشمندان که کارهای پایهای انجام دادهاند، ممکن شده است. کشت بافت گیاهی اصطلاحی است که بطور کلی برای رشد درون شیشهای و عاری از بیماری گیاه بر روی محیط مغذی بکار میرود. این تکنولوژی بر سه اصل اساسی استوار است (باقری و همکاران، 1381):
* قسمتی که باید از گیاه اصلی جدا شود.
* ریزنمونه باید در شرایط شیمیایی (محیط کشت) و فیزیکی (محیطی) تعریف شده نگهداری شود.
* شرایط استریل و عاری از آلودگی باید حفظ شود

شکل 1-1 گیاه پپرومیا (برگ قاشقی)

دانش امروزی اجازه بکارگیری هر قسمت از گیاه را برای شروع کشت میدهد. قسمتی از گیاه که برای این منظور بکار میرود ریزنمونه نامیده میشود. انتخاب هر قسمت از گیاه با توجه به هدف از کشت متفاوت است. مواد و نمونههایی که از محیط خارج جمعآوری و به آزمایشگاه آورده میشوند، در حین انتقال، بهتر است در شرایط مناسب نگهداری شوند تا فعالیتهای کاتابولیکی به حداقل برسد. مواد بطور کامل باید با آب جاری و مایع شوینده شستشو داده شوند (مانند تویین-801)، بعد از شستشو و حذف ذرات چسبنده بسته به نوع ریزنمونه مراحل استریل انجام شده و سپس کشت انجام میشود. کشت بافت گیاهی یا کشت درون شیشهای عبارت است از رشد سلول، بافت و یا اندام گیاهی در یک محیط غذایی مصنوعی استریل که به صورت جامد یا مایع تهیه میشود، این روش به عنوان یکی از شاخههای زیستفناوری، کاربرد گستردهای در کشاورزی دارد. در کشت بافت، قسمتی از گیاه به نام قلمه یا ریزنمونه که ممکن است بخشی از ساقه، برگ، جوانه و یا یک سلول باشد، در محیط کنترل شده کشت میشود. در این نوع کشت، شرایط به گونهای است که عاری از هرگونه میکروارگانیسم بوده و رژیم متعادلی از مواد شیمیایی و آلی مورد نیاز رشد گیاه فراهم است. در واقع در کشت درون شیشهای محیط کشت بستری برای رشد گیاه است و ترکیبی از مواد شیمیایی و آلی در یک ژل مغذی یا محیط مایع برای رشد سلولها و بافتها میباشد (شریفی و همکاران، 1389).
در سال 1838 شوان و شیلدن2 نظری? توتیپوتنسی3 را ارائه نمودند. براساس این نظریه، هر سلول گیاهی، هنگامی که در محیط غذایی مصنوعی و شرایط مناسب کشت شود، میتواند به گیاهی جدید و کامل تبدیل شود. بعدها دانشمند آلمانی، هابرلند4 (1902) برای اولین بار به بررسی این نظریه پرداخت و ادعا کرد که اگر محیط و تغذیه سلولهای کشت شده مناسب باشند، سلولهای کشت شده میتوانند، گیاهان نرمالی را بوجود آورند. اما تلاشهای او در انجام کشت بافت ناموفق بود. او همچنین معتقد بود که قطعه قطعه کردن نامحدود بافتهای گیاهی بر روی قدرت تکثیر سلولها تأثیر نمیگذارد. او استفاده از مایع موجود در کیسه جنینی و تولید جنینهای مصنوعی را از سلولهای رویشی پیشنهاد کرد (احمدیان، 1380). به دلیل تاخیر در کشف هورمونهای گیاهی، کشت بافت گیاهی پس از کشت بافت حیوانی و انسانی شروع شد. اولین کشت موفقیتآمیز بافتهای گیاهی، توسط وایت5 در سال 1934 انجام شد. او در سال 1939 اولین کشت موفقیتآمیز کالوس هویج و توتون را گزارش کرد. اولین هورمون تنظیمکننده رشد که کشف شد، اکسین بود که موفقیت بزرگی را برای کشت بافت در شرایط درون شیشهای به همراه داشت. بعد از کشف تنظیمکننده رشد کینتین در سال 1955، انگیزه بیشتری برای کشت بافت حاصل شد. بزرگترین مشوق برای استفاده از فنون کشت بافت گیاهی برای تکثیر بسیاری از گونهها، ممکن است کار اولیه مورل6 روی تکثیر ارکیده و کار موراشیگ و اسکوگ7 در 1964 در ایجاد محیط کشت جدیدی با غلظت بالای نمکهای معدنی بوده باشد (احمدیان، 1380).

1-4 ترکیبات محیطهای کشت
محیط کشت یکی از مهمترین اجزاء کشت یاخته و بافت گیاهی است. کاربرد موفق فنون کشت بافت گیاهی به میزان زیادی به محیط کشتی با ترکیب صحیح بستگی دارد. ترکیب محیطهای کشت به روش خاص کشت به کار رفته تغییر مییابد. برای نمونه روشهایی مانند باززایی گیاهان کامل از یاختهها یا بافتها