ازمند محیطهای کشتی با ترکیبات مختلف برای آغازش هریک از مراحل توالی تکوینی است. علاوه بر ترکیب آن، نقش مهم دیگر محیط کشت فراهم کردن محیط فیزیکی مناسب برای یاختهها و بافتها برای رشد میباشد. برای نمونه محیطهای کشت جامد، نقشی شبیه خاک را از طریق فراهم کردن یک زمینه و حامل فیزیکی که ریزنمونههای بافت بتوانند تماس با هوا را برای تبادل گاز حفظ نمایند یا جایی که گیاهچههای باززایی شده بتوانند ریشه دهند، ایفا میکنند. از سوی دیگر، کشتهای تعلیقی در حال رشد در کشت مایع در حال تکان خوردن، یاختهها را قادر میسازد تا حداکثر تماس را با اجزای محیط کشت حفظ کنند و تبادل گازها تسهیل شود. تمام یاختههای گیاهی زنده برای حفظ و رشد و نمو نیازمند آب، عناصر غذایی (عناصر معدنی و ترکیبات آلی) و تنظیمکنندههای رشد گیاهی (هورمونها) هستند. ترکیبات محیطهای کشت بافت گیاهی معمولا این نیازمندیها را منعکس میسازند و چندین ترکیب اختصاصی (مانند محیط کشت موراشیک و اسکوگ یا محیط ام. اس) که به طور رایج برای کشت به کار میروند دارای ترکیبات پایه مشابهی هستند. مواد مورد نیاز برای کشت یاخته گیاهی را میتوان به سه گروه تقسیم کرد که عبارتند از: عناصر غذایی معدنی، عناصر غذایی آلی و تنظیمکنندههای رشد گیاهی (باقری و همکاران، 1383؛ شریفی و همکاران، 1389).

1- 4 – 1 مواد غیر آلی
عناصر غذایی غیر آلی، عناصر معدنی هستند و معمولا بر اساس غلظتهای ضروری به دو گروه تقسیم میشوند: عناصر پرمصرف که در مقادیر زیاد (غلظتهای میلیمول) و عناصر کممصرف که تنها در غلظتهای بسیار پایین (میکرومول) ضروری میباشند. عناصر پرمصرف شامل: نیتروژن، گوگرد، فسفر، کلسیم، منیزیم، پتاسیم و عناصر کممصرف شامل: آهن، بر، کبالت، مس، ید، منگنز، مولیبدن و روی هستند. عناصر غذایی آلی در حالی که گیاهان سبز خودپرور هستند، ولی بیشتر سیستمهای کشت حداقل در مراحل اولیه، خودناپرور میباشند و به یک منبع آلی کربن و انرژی نیازمند هستند. کشتها برای آغاز توسعه کلروپلاستها و فتوسنتز اغلب در روشنایی پرورش داده میشوند. علاوه بر یک منبع آلی از کربن و انرژی، کشتهای گیاهی ممکن است به مولکولهای آلی پیچیده برای رشد سالم نیز نیازمند میباشند (خسروشاهلی و همکاران، 1386).

1- 4- 2 منبع کربن

قندها برای تامین کربن و انرژی به محیطهای کشت گیاهی افزوده میشوند. ساکارز متداولترین قند مورد استفاده در محیطهای کشت گیاهی است، ولی گلوکز، فروکتوز و سوربیتول در برخی از محیطهای کشت مورد استفاده قرار میگیرند. علاوه بر نقش متابولیکی آن، ساکارز همچنین به عنوان یک اسمزنگهدار عمل میکند و همراه با عناصر غذایی معدنی به تعادل پتانسیل اسمزی محیط کشت کمک میکند (شریفی و همکاران، 1389).

1 – 4 – 3 ویتامینها
ویتامینهای افزوده شده، برای کشتهای یاخته و بافت گیاهی ضروری نیستند، هرچند ویتامین B1 (تیامین) برای کشتهای برخی از گونهها سودمند تشخیص داده شده است. با وجود این بیوتین، اسیدپانتوتنیک، اسیدنیکوتینیک (نیاسین)، پیریدوکسین (پیریدوکسول، ویتامین B6)، اسیدفولیک، اسیداسکوربیک (ویتامین C) و توکوفرول (ویتامین E) به برخی از محیطهای کشت افزوده میشود. افزودن انفرادی عصاره مخمر8 گاهی اوقات به عنوان منبع ویتامینها صورت میگیرد. الکل قند میواینوزیتول به وفور در محیطهای کشت برای گیاهان تک لپهای، بازدانگان و برخی از گیاهان دولپهای به کار میرود. این الکل قندی نقشی را در توسعه دیواده یاخته و غشاء ایفا میکند (باقری و همکاران، 1383).

1 – 4 – 4 آمینواسیدها و مکملهای آلی
آمینواسیدها هنگام کاهش نیتروژن نقش خود را ایفا میکنند. در صورت ناکافی بودن نیتروژن، مکمل نیتروژن آلی کمپلکس مانند کازئینهیدرولیزات (1-1/0 گرم بر لیتر) ممکن است افزوده شود. گلایسین آمینواسیدی است که عموما استفاده میشود. سایر مکملهای آلی عبارتند از شیر نارگیل، عصاره مخمر، پپتون و عصاره جو، هرچند محیطهای کشت مصنوعی ترجیح داده میشوند و مکملهای آلی که طبیعت شیمیایی ناشناخته دارند فقط در مواقع ضروری بکار میروند (ابراهیم زاده و همکاران، 1384).

1 – 4- 5 تنظیمکنندههای رشد گیاهی
پنج گروه اصلی از تنظیمکنندههای رشد گیاهی یا هورمونهایگیاهی وجود دارد که رشد و تمایزیابی در گیاه را هماهنگ میکنند و عبارتند از: اکسینها، سایتوکینینها، جیبرلینها، اسیدآبسزیک و اتیلن. اتیلن به طور عمده در ریزش، پیری گل و رسیدن میوه موثر است و به ندرت در کشتهای بافت گیاهی به کار میرود. از چهار گروه دیگر هورمونهای گیاهی، اکسینها و سایتوکینینها به وفور در کشتهای بافت گیاهی به کار میروند و جیبرلینها و اسید آبسزیک گهگاه مورد استفاده قرار میگیرند (خسروشاهلی و همکاران، 1386).

1 – 4 – 6 عامل ژلهایکننده
برای کشت بافت نیاز به یک عامل جامدکننده محیطی است تا نمونه به راحتی روی آن قرار گیرد و از غوطهور شدن آن جلوگیری به عمل آید (جورج و همکاران، 1987).

1- 4 – 6 – 1 آگار
آگار متداولترین ژل مورد استفاده در کشت بافت گیاهی است. آگار، پلیساکارید پیچیدهای است که از جلبک قرمز استخراج شده است و از دو بخش آگارز (70 درصد) و آگاروپکتین (30 درصد) تشکیل شده است. آگارز بخش ژلساز بوده و شامل پلیمری از واحدهای مونوساکارید متناوب د-گالاکتوز و 3،6- آنیدروگالاکتوز است. آگار در دمای حدود 100 درجه سانتیگراد ذوب میشود و در دمای حدود 35 درجه سانتیگراد به حالت ژل در میآید. آگار پایدار است، با اجزای محیطهای کشت واکنش نمیدهد و به طور طبیعی توسط آنزیمهای گیاهی هضم نمیشود (ابراهیم زاده و همکاران، 1384).

1-5 ظروف کشت
نوع ظروف استفاده شده در کشت بافت اثرات قابل توجهی بر سرعت رشد کشتها، کیفیت ساقهها و گیاهچههای تولید شده و درجه ی شیشهای شدن دارد. در این مورد بویژه حجم ظرف، رطوبت هوا در فضای بالای کشت درون ظرف و میزان تبادل گازی با هوای بیرون ظرف اهمیت خاصی دارد (مک کون و سلمر9، 1987).

1 – 6 انتخاب و تهیه ریزنمونه
زمانی که گیاه دهنده ریزنمونه در گلخانه یا اتاقک رشد پرورش مییابند، گیاهان در تمام طول سال در مرحله مناسبی از رشد میتوانند در دسترس باشند. اما ریزنمونههای حاصل از درختان فقط زمانی برای ریزازدیادی در شرایط مطلوب هستند که به موقع جمعآوری شوند. نگهداری مواد گیاهی جمعآوری شده در زمان مناسب، طول دورهای را که از آن میتوان استفاده نمود افزایش میدهد (احمدیان، 1380).

1 – 7 ریزازدیادی
سه نوع اصلی ریزازدیادی عبارتاند از: 1- رشد طولی ساقه جانبی (پرآوری) 2- اندامزایی 3- جنینزایی
رشد طولی ساقه جانبی زمانی انجام میشود که جوانههای جانبی که بطور معمول غیرفعالاند، از غالبیت انتهایی رهایی یابند. این کار بیشتر از طریق تغییر هورمونها (اساساً سایتوکینینها) در محیط کشت غذایی اعمال میشود. برای رشد طولی ساقه جانبی، فراوانترین نوع ریزنمونه قطعات کوچک ساقه یا تک گره است. میزان تشکیل ساقه جانبی گاهی اوقات پس از چند واکشت افزایش مییابد (خسروشاهلی و همکاران، 1386).
در اندامزایی ساقههای نابجایی القاء میشوند که سپس ریشهدار میگردند. در این حالت به ندرت ریشهها قبل از ساقه ایجاد میشوند. در جنینزایی، جنینهای سوماتیکی از رشد یک سلول ایجاد شده و پس از بلوغ به یک گیاه کامل تبدیل میشوند.

1-8 کودهای زیستی
مسئله استفاده بیرویه و نادرست از سموم و کودهای شیمیایی بسیار جدی و از چند جنبه قابل بررسی است. از مهمترین آن آسیب زیست محیطی و بهداشتی است. جنبه دیگر نیز بُعد اقتصادی آن است. بقایا و آثار ترکیبات کود شیمیایی در محیط آب و خاک موجب برهم خوردن تعادل اکوسیستمها میشود. این معایب کودهای شیمیایی و هزینه بالای تولید آنها باعث شد که تولید کودهای زیستی مورد توجه جدی قرار گیرد. در نظامهای کشاورزی پایدار کاربرد کودهای زیستی از اهمیت ویژهای در افزایش باروری و حفظ حاصلخیزی پایدار خاک برخوردار است. امروزه استفاده از ظرفیتهای طبیعی ارگانیسمهای مفید خاکزی با هدف بهرهگیری از توانایی و پتانسیل آنها به منظور تولید حداکثر محصول مورد توجه قرار گرفته است (وسی، 2003).
دامنه میکروارگانیسمهای خاکزی مورد استفاده در تولید کودهای زیستی در طول قرن بیستم توسعه بسیاری یافته است و امروزه طیف وسیعی از باکتریهای خاکزی (انواع ریزوبیوم، سودوموناس، ازتوباکتر، آزوسپریلوم، باسیلوس و غیره)، قارچها (انواع قارچهای میکوریزی و اندوفیتی) و جلبکها با مکانیسمهای مختلف برای تولید کودهای زیستی استفاده میشوند. با این حال هنوز هم باکتریها فراوانترین انواع در تولید کودهای زیستی محسوب میشوند. امروزه کودهای زیستی در فرمولاسیونهای متفاوت برای محصولات مختلف کشاورزی از قبیل غلات، سبزی و صیفی، گیاهان صنعتی، باغات و گلخانهها استفاده میشوند (اسدی رحمانی، 1389). اهمیت استفاده از PGPRها برای گیاهان مختلف به عنوان کود زیستی هر روزه در حال افزایش میباشد و تحقیقات وسیعی در این مورد در حال اجراست. اما امکان استفاده از این موجودات در تحقیقات آزمایشگاهی گیاهی از جمله کشت بافت گیاهی هنوز در حال بررسی است. با توجه به اینکه این میکروارگانیزمها انواع مواد را به محیط اضافه میکنند، احتمال اینکه بر روی مراحل مختلف کشت بافت از ایجاد کالوس تا مرحله انتقال به خاک اثرات مثبتی داشته باشند وجود دارد. در این مورد گزارشهای بسیار اندکی موجود است و تحقیق بر روی این موضوع ضروری به نظر میرسد (احمدزاده، 1392).

1-9 باکتریهای محرک رشد گیاه (PGPRsها10)
باکتریهای ریزوسفری محرک رشد گیاه (PGPR) به گروه نامتجانسی از میکروارگانیزمها اطلاق میشوند که سبب افزایش رشد گیاه میشوند (وسی11