اهی را تحت شرایط استریل و در محیط‌های کنترل شده در بر می‌گیرد. تکنولوژی کشت بافت و سلول گیاهی (که کشت in vitro نیز گفته می شود) بر اساس انواع روش‌هایی که دامنه‌ای از کشت پروتوپلاست‌ها تا باززایی و تکثیر همسانه‌ای گیاهان کامل را شامل می‌شوند، قرار دارد. توانایی پرورش سلول‌ها و بافت‌های گیاهی در محیط کشت و منتقل نمودن آنها، پایه بسیاری از کاربردهای عملی این تکنیک را در کشاورزی تشکیل می‌دهد و یک پیش نیاز برای مهندسی ژنتیک گیاهی است (اتوس و همکاران، 2005).
1-6-1- محیط کشت و مواد غذایی مورد نیاز برای رشد
کاربرد موفق روش‌های کشت بافت به طور عمده به محیط کشت با ترکیبات درست وابسته است. علاوه بر ترکیب، کار مهم دیگر محیط کشت این است که محیط فیزیکی مناسبی برای رشد سلول‌ها و بافت‌ها فراهم کند. نیازهای غذایی کشت بافت گیاهی می تواند به سه گروه تقسیم گردد: مواد غذایی غیر آلی (معدنی)، مواد غذایی آلی و تنظیم کننده‌های رشد گیاهی (اتوس و همکاران، 2005).

1-6-1-1- مواد غذایی غیر آلی
این مواد بر اساس غلظت مورد استفاده‌شان به دو گروه تقسیم می شوند: درشت مغذی‌ها و ریزمغذی‌ها. بر اساس نظریات انجمن بین المللی فیزیولوژی گیاهی، عناصری که در غلظت‌های بیش از 5/0 میلی مول بر لیتر مورد نیاز گیاه باشند، درشت مغذی‌ها و عناصری که در کمتر از این غلظت مورد نیاز گیاه باشند، ریزمغذی‌ها نامیده می‌شوند (اتوس و همکاران، 2005).
انتخاب مخلوط نمک‌های درشت مغذی و ریزمغذی، شدیداً به گیاه مورد مطالعه بستگی دارد. کاربرد محیط کشت موراشیگ و اسکوگ یا MS به دلیل اینکه بسیاری از گیاهان به آن عکس‌العمل مناسبی نشان می‌دهند، بسیار متداول است. در هر حال باید توجه داشت که این محیط کشت الزاماً همیشه برای رشد و نمو، ایده آل نیست، زیرا میزان نمک در آن خیلی بالاست (باقری، 1376).
درشت مغذی‌های استفاده شده در محیط کشت، نیتروژن (N)، گوگرد (S)، فسفر(P)، کلسیم(Ca)، منیزیم(Mg) و پتاسیم(K) را در بر می‌گیرند. ریزمغذی‌های مورد نیاز در محیط کشت شامل آهن (Fe)، بر (B)، کوبالت (Co)، مس (Cu)، ید (I)، منگنز (Mn)، مولیبدن (Mo) و روی (Zn) می‌باشد.

1-6-1-2- مواد غذایی آلی
یک جزء مهم همه محیط‌های کشت، منبع انرژی است که به این منظور ساکارز به طور وسیعی استفاده می‌شود. در واقع ساکارز رایج ترین قند مورد استفاده در محیط کشت گیاهی است، اما گلوکز، فروکتوز و سوربیتول نیز در برخی فرمولاسیون‌ها به کار می‌روند. ساکارز علاوه بر نقش متابولیکی‌اش، به عنوان یک اسموتیکوم عمل کرده و به همراه عناصر غذایی غیر آلی، به تعادل پتانسیل اسمزی محیط کشت کمک می‌کند (اوانس و همکاران، 2003).
معمولاً در کشت in vitro از ساکارز با غلظت 1 تا 5 درصد استفاده می‌شود. غلظت قند انتخاب شده، بستگی زیادی به نوع و سن مواد در حال رشد دارد. به عنوان مثال جنین‌های بسیار جوان، به نسبت بسیار بالایی از قند احتیاج دارند (باقری، 1376).
ویتامین‌ها برای کشت بافت ضروری نیستند، هرچند ویتامین B1 (تیامین) تصور می شود برای کشت برخی گونه‌ها سودمنذ باشد. به هر حال بیوتین، اسید پانتوتنیک، اسید نیکوتینیک (نیاسین)، پیریدوکسین (ویتامین B6)، اسید فولیک، اسید آسکوربیک (ویتامین C) و ویتامین E به برخی محیط‌های کشت افزوده می‌گردد. الکل قندی میواینوزیتول به وفور برای تک لپه‌ایها، بازدانگان و برخی دو لپه‌ایها در محیط کشت به کار می‌رود.

1-6-1-3- تنظیم کننده‌های رشد گیاهی
توسعه کشت بافت به عنوان یک دانش پایه، به طور نزدیکی با کشف و شناسایی تنظیم کننده‌های رشد گیاهی در ارتباط است (اوانس و همکاران، 2003).
یک دسته از تنظیم کننده‌های رشد گیاهی، اکسین‌ها هستند. اکسین عمده در گیاهان ایندول-3- اسید استیک (IAA) می‌باشد. کاربرد اساسی اکسین تحریک رشد طولی سلول‌هاست. در کشت بافت گیاهی، اکسین به همراه سیتوکنین برای کنترل تمایز و اندام زایی به کار می‌رود. اکسین‌های طبیعی به ندرت در کشت بافت استفاده می شوند و اکسین‌های ساختگی یعنی 2،4-دیکلوروفنوکسی استیک اسید (2,4-D)، 1-نفتالین استیک اسید (NAA) و ایندول بوتیریک استیک اسید (IBA) رایج ترین جایگزین‌ها هستند (اوانس و همکاران، 2003). استفاده از 2,4-D می‌تواند مانع از فتوسنتز شود. درحالیکه در استفاده از اکسین‌های NAA، IBA و IAA چنین اتفاقی نمی‌افتد (باقری، 1376).
در غلظت کم اکسین، تشکیل ریشه‌های نا بجا حالت غالب دارد. درحالیکه در غلظت‌های زیاد اکسین، تشکیل ریشه صورت نمی‌گیرد و تشکیل کالوس اتفاق می‌افتد (باقری، 1376).
دسته دیگر تنظیم کننده‌های رشد گیاهی، سیتوکنین‌ها می باشند. سیتوکنین‌ها رشد و نمو را توسعه می‌دهند، پیری را به تاخیر می‌اندازند و به همراه اکسین‌ها برای کنترل رشد و نمو به کار می‌روند. اولین سیتوکنینی که شناسایی شد، کاینتین بود، پس از آن زآتین از دانه ذرت جدا شد. رایج‌ترین سیتوکنین‌های به کار رفته در کشت بافت، کاینتین، بنزیل آمینو پورین (BAP یا BA)، زآتین و آدنین را شامل می‌شوند. آدنین برای اولین بار توسط اسکوگ و توی (1984) در رشد ساقه ریزنمونه‌های توتون به کار برده شد و باعث تحریک تشکیل ساقه نابجا شد.
نیچ و همکاران (1967) نیز از آدنین برای تسریع در تشکیل ساقه‌های نابجا استفاده کردند. این ماده برای تکثیر رویشی گیاهان در غلظت‌های 2 تا 120 میلی گرم در لیتر به کار می‌رود. از آدنین سولفات می‌توان به جای آدنین استفاده کرد، چون در آب بیشتر حل می‌شود (باقری، 1376).
گروهی دیگر از تنظیم کننده‌های رشد ، جیبرلین‌ها هستند. در گیاهان عمل اصلی جیبرلین‌ها تحریک طویل شدن ساقه و گلدهی است. جیبرلین‌ها همچنین در تحرک ذخایر غذایی از آندوسپرم در مراحل آغازین رشد جنین و جوانه‌زنی بذرهای غلات شرکت دارند. جیبرلین‌ها یک خانواده شیمیایی بسیار بزرگ با بیش از 90 جیبرلین مختلف شناخته شده در گیاهان هستند. در کشت بافت گیاهی، جیبرلین‌ها برای القاء اندام‌زایی به کار می‌روند. تنها GA3، GA4 و GA7 در کشت‌های گیاهی رایج هستند (اوانس و همکاران، 2003؛ فارسی و ذوالعلی، 1382).
1-6-2- زغال فعال
زغال فعال ماده‌ای دارای شبکه بسیار ظریف از سوراخ‌ها با یک سطح داخلی بزرگ است که بسیاری مواد می‌توانند بر روی آن جذب شوند. این ماده اغلب در کشت بافت به منظور بهبود رشد و نمو سلول به کار می‌رود. زغال فعال با جذب غیر قابل برگشت ترکیبات بازدارنده در محیط کشت در واقع موجب کاهش متابولیت‌های سمی می‌گردد. از طرف دیگر در جذب موادی مثل ویتامینه‌ها، آهن، و برخی هورمون‌ها به گیاه کمک می‌کند (توماس، 2008).
اثرات زغال فعال بر پاسخ بافت در کشت in vitro به نظر می‌رسد نه تنها به نوع زغال فعال و درجه فعالیت آن، بلکه به گونه‌های گیاهی کشت شده بستگی دارد. افزودن زغال فعال به محیط کشت ممکن است بسته به محیط کشت، بافت مورد استفاده و یا اهداف محقق، اثر مثبت یا منفی بر رشد و نمو داشته باشد (پان و استادن، 1998).

1-6-3- ریزازدیادی
یکی از تکنیک‌های کشت بافت، ریزازدیادی است. تکثر کلون در شرایط in vitro را ریز ازدیادی نامند. تکثیر کلون عبارت است از ازدیاد افرادی با محتوای ژنتیکی کاملاً مشابه با استفاده از تولید مثل غیر جنسی و کلون، جمعیتی از گیاهان است که از یک گیاه منفرد به وسیله تولید مثل غیر جنسی به وجود آمده است (فارسی و ذوالعلی، 1382).
مزیت مهم استفاده از روش‌های تکثیر کلون در شرایط استریل (ریزازدیادی) نسبت به روش‌های مرسوم این است که در زمان و فضای نسبتاً محدود، از یک فرد می‌توان جمعیت بزرگی به دست آورد. تخمین زده شده است که روش تکثیر جوانه جانبی، تعداد ساقه را در هر دوره یک ماهه کشت به طور متوسط تا 10 برابر افزایش می‌دهد و در یک دوره شش ماهه امکان تولید بیش از یک میلیون واحد تکثیری یا گیاه از یک ریزنمونه وجود دارد (فارسی و ذوالعلی، 1382).
تکنیک‌های ریزازدیادی به منظور افزایش سریع تعداد افراد در گونه‌های با مشکلات تولید مثلی و یا با جمعیت‌های بسیار کاهش یافته به کار می‌روند. مثال‌های متعددی وجود دارد که در آنها ریزازدیادی، امکان افزایش در تعداد افراد را در شرایط ex situe برای قطع فشار جمع آوری در طبیعت هم به وسیله عموم و هم به وسیله محققان فراهم می‌سازد (یا خواهد ساخت) (بنتو و مارتین، 2010).
مزیت دیگری از تکنیک‌های کشتin vitro این است که می‌توانند جایگزینی برای بانک‌های بذر با گونه‌‌های بسیار محدود، که در آنها عمل ساده جمع‌آوری بذر در جمعیت طبیعی ممکن است بر بقای آن تاثیر بگذارد، یا با گونه‌های با موفقیت تکثیر جنسی پائین باشند (بنتو و مارتین، 2010).
موراشینگ در سال 1974 سه مرحله اصلی فرآیند ریزازدیادی را طراحی نمود:
مرحله 1- انتخاب ریزنمونه‌های مناسب، استریلیزاسیون و انتقال آنها به محیط کشت غذایی به منظور تثبیت (شروع کشت استریل).
مرحله 2- تولید یا تکثیر ساقه‌ها از ریزنمونه‌های موجود در محیط کشت.
مرحله 3- انتقال ساقه‌ها به یک محیط کشت ریشه‌دهی و سپس انتقال آنها به خاک.
البته تکثیر in vitro تمام گونه‌ها مستلزم اجرای هر سه مرحله نیست و این مراحل فقط به منظور توصیف فرآیندهای ریزازدیادی و تسهیل مقایسه بین دو یا چند سیستم ارئه شده‌اند (فارسی و ذوالعلی، 1382).