ی ژنتیکی مانند سیستیک فیبروزیس اتفاق می افتد میزان آمیلاز به صورت متوسط افزایش می یابد و یا در موارد آسیب و از بین رفتن سلولهای سازنده آمیلاز میزان این آنزیم کاهش می یابد.در اندازه گیری آمیلاز باید توجه داشت که داروهایی مانند آسپیرین، ضد بارداری های خوراکی، استروئیدها مانند کورتیکوستروئیدها، ایندومتاسین و همچنین داروهای مدر باعث افزایش آمیلاز می شود(9).
2-2- آلفا آمیلاز:
آلفا آمیلاز (EC 3.2.1.1) نوعی آنزیم است که اتصالات آلفای پلی ساکارید های بزرگ دارای پیوند آلفا، مانند نشاسته و گلیکوژن را به گلوکز و مالتوز هیدرولیز می کند(45). آلفا آمیلاز بیشترین فرم آمیلاز موجود در انسان ها و پستانداران می باشد. البته آلفا آمیلاز در بعضی دانه های گیاهی حاوی نشاسته حضور دارد و توسط بسیاری از قارچ ها هم ترشح می شود(71).
آلفا آمیلاز یک متالوآنزیم است که حداقل دارای یک یون Ca2+ می‌باشد و بدون حضور کلسیم نمی‌تواند به طور کامل فعال باشد. تعداد یون Ca2+ از یک تا ده متفاوت است(41). (شکل2-1)
3شکل 2- 1- نمایی شماتیک از آلفا آمیلاز یون کلسیم به رنگ خاکی و یون کلرید به رنگ سبز است.
2-2-1-کارکرد آلفاآمیلاز :
آلفاآمیلاز زنجیره کربوهیدراتی نشاسته را در مکان‌های تصادفی هیدرولیز کرده و تولید الیگوساکاریدهای کوتاه، مالتوز و گلوکز می‌کند. این واکنش بوسیله افزایش میزان قندهای احیا و کاهش رنگ آبی و یا از طریق تست برنفلد و تولید رنگ زرد قهوه‌ای در کمپلکس ید و نشاسته پایش می‌شود. براساس سیستم طبقه‌بندی که براساس شباهت توالی آمینو اسیدی طراحی شده است اکثر آنزیم‌های تجزیه کننده نشاسته از جمله آلفا آمیلازها در خانواذه ?? گلیکوزیل هیدرلازها قرار می‌گیرند. آلفا آمیلازها دارای چهار ناحیه حفاظت شده در توالی اولیه خود می‌باشند، برخی از این نواحی حفاظت شده مربوط به جایگاه فعال‌اند و برخی در پایداری ساختار سوم حفاظت شده نقش دارند. آلفا آمیلازها دارای یک ساختار8?/?))یا4 TIM barrel (بشکه?/?) می‌باشند. یک سری قوس‌های ?-?-? طوری آرایش می‌یابند که نتیجه آن ایجاد یک ساختمان پایدار می‌باشد، این موتیف را بشکه?/? می‌نامند(9).
آلفا آمیلاز یک آنزیم القاپذیر است که معمولاً در حضور نشاسته و محصولات هیدرولیزی نشاسته مانند مالتوز القا می‌شود. آلفا آمیلاز همانند سایر آنزیم‌های القاپذیر در حضور گلوکز و سایر قندها تحت تاثیر مهار کاتابولیک قرار می‌گیرد(9).
2-2-2- آلفا آمیلاز در فیزیولوژی انسان:
اگرچه آمیلاز در بسیاری از بافت های بدن یافت می شود اما عمدتا در بزاق و مایع پانکراس (لوزولمعده) به وفور یافت می شود که هر یک دارای ایزوفرم آلفا آمیلاز انسانی مخصوص خود می باشند. آنها در فشار ایزوالکتریکی رفتار های متفاوتی دارند ، و همچنین می توانند در آزمایش با استفاده از آنتی بادی مونوکلونال جدا شوند. در انسان، همه ایزوفرم های آمیلاز مرتبط به کروموزوم 1p21 می باشند (67).
2-3- آمیلاز بزاقی یا ptyalin :
آمیلاز در بزاق یافت می شود و نشاسته را به مالتوز و دکسترین می شکند. این شکل از آمیلاز “ptyalin”یا “ماده تخمیری بزاق” نیز نامیده می شود(44). این آنزیم در بزاق مولکول های بزرگ و غیر حلال نشاسته را به نشاسته ی حلال (آمیلودکسترین، اریترودکسترین و آکرودکسترین) می شکند، که منجر به تولید قطعات کوچکتر از نشاسته و در نهایت مالتوز می گردد. Ptyalin بر اتصالات خطی ? 1)به(4 گلیکوزیدی عمل می کند اما هیدرولیز کامل ترکیب نیازمند آنزیم اثر کننده بر ترکیبات شاخه دار می باشد. آمیلاز بزاقی در معده توسط اسید معده غیر فعال می گردد. pH مایع معده حدود 3/3 است و ptyalin بمدت 20 دقیقه در درمای °C37 کاملا غیر فعال می شود(17).
2-3-1- تنوع ژنتیکی در آمیلاز بزاقی:
ژن آمیلاز بزاقی در طول تکامل تحت تکثیرقرار گرفته، و مطالعات هیبریداسیون DNA نشان می دهد که افراد بسیاری دارای چندین تکرار پشت سر هم ژن می باشند. تعداد کپی های این ژن مرتبط با میزان های آمیلاز بزاقی می باشند که با استفاده از تکنیک های وسترن بلاتینگ و آنتی بادی های مخصوص آمیلاز انسانی اندازه گیری شده اند(78).
2-4- آلفا آمیلاز پانکراس:
آلفا آمیلاز پانکراس به طور تصادفی اتصالات خطی ? 1)به(4 گلیکوزیدی آمیلوز را می شکند که نهایتا محصول آن دکسترین، مالتوز یا مالتوتریوز می باشد(9).
2-5- آلفا آمیلاز در پاتولوژی:
آزمایشات پزشکی معمولا هم آمیلاز پانکراسی و هم آمیلاز کل را اندازه گیری می کنند. انجام تست مربوط به بررسی آمیلاز در مقایسه با لیپاز آسان تر است.از آنجایی که میزان موجود این آنزیم در خون کم است، زمان تست هنگام گرفتن نمونه خونی برای این اندازه گیری بسیار حیاتی می باشد. خونگیری باید بلافاصله (سریعترین زمان ممکن) پس از درد پانکراسی گرفته شود در غیر این صورت به سرعت توسط کلیه ها دفع می شود.آلفا آمیلاز بزاقی به عنوان بیومارکری برای تشخیص استرس استفاده می شود که نیازی به خون گیری ندارد(9).
2-5-1- تفسیر میزان آلفا آمیلاز:
افزایش میزان پلاسمایی آلفا آمیلاز در انسان در موارد زیر یافت می شود:
ترومای بزاقی (شامل لوله گذاری بیهوشی)
اوریون – به دلیل التهاب غدد بزاقی
پانکراتیت – به دلیل صدمه به سلول های تولید آمیلاز
نارسایی کلیوی – به علت کاهش دفع
استرس
خواندن آمیلاز نهایی بالای 10 برابر از محدوده ی نرمال (ULN5) احتمالا به دلیل بیماری پانکراس یا پانکراتیتیس می باشد. 5 تا 10 برابر میزان طبیعی ممکن است نشان دهنده 6ایلئوس یا بیماری اثنی عشر و یا نارسایی کلیوی باشد، و میزان کمتر از نرمال، عموما در بیماری های غدد بزاقی یافت می شود (63و4و13).
2-6- بافر محدود کننده آلفا آمیلاز:
مولکول تریس به عنوان مهار کننده تعدادی از ?-آمیلاز های باکتریایی گزارش شده است(20و2)، از این رو بهتر است در زمان انجام مطالعه یا به کاربردن آنزیم از بافر تریس استفاده نشود.
2-7- مطالعه فعالیت آنزیم:
بسیاری از روشهای اندازه گیری فعالیت آلفا آمیلاز برای بررسی آنزیم موجود در مایعات بدن یا عصاره های برگرفته از دانه های گیاهی طراحی شده است.
روشهای رنگ سنجی بر اساس اندازه گیری رنگ آبی نشاسته – ید است که توسط فووا در دهه پنجاه میلادی ابداع شد تا آن زمان تمام متدهای اندازه گیری آمیلاز در یکی از این سه روش خلاصه می شد؛ یدومتریک، ساکاروژنیک و ویسکومتریک(19).
2-7-1- روشهای اندازه گیری فعالیت آلفاآمیلاز تا قبل از روش رنگ سنجی:
در روش یدومتریک ، فعالیت آمیلاز به صورت زمان لازم برای یک نمونه آنزیم مجهول جهت تبدیل سوبسترای بیرنگ از محلول آبی کمپکس نشاسته- ید، بیان می شود. این روش زیاد قابل اعتماد نبود زیرا غلظت آنزیم با کاهش رنگ رابطه خطی نداشت، همچنین رنگ آبی تحت تأثیر دما و عوامل دیگر پایداری خود را از دست می داد(73).
روش ساکاروژنیک بر اساس اندازه گیری گروههای احیاکننده تولید شده در اثر عمل هیدرولیز نشاسته طراحی شده بود. بنابراین با اندازه گیری قدرت کاهندگی محلول آنزیم – سوبسترا قبل و بعد از انکوباسیون، فعالیت آنزیم را اندازه می گرفتند. کاهندگی با استفاده از ترکیبات مس سنجیده می شد و به صورت میلی گرم گلوکوز آزاد شده بیان می شد(62). محدودیت آن، مداخله عوامل احیا کننده فرعی درمحیط بود که در سرم بیماران دیابتی کنترل این مسأله مشکل زا است و از طرفی آماده سازی سوبسترا نیز مشکل بود.
در روش ویسکومتریک که توسط دیویسون معرفی شد(15)، کاهش وزن مولکولی نشاسته که در ویسکوزیته محلول مؤثراست، اساس سنجش بود. این اندازه گیری در ویسکوزیمتر “استوالد” انجام می شد. زمان لازم برای کاهش ویسکوزیته تا بیست درصد، بیانی از فعالیت آنزیم بود (16).
زمان انکوباسیون حتماً متغیر بود زیرا سیالیت رابطه ای خطی با زمان ندارد؛ سرم حاوی آنزیم موردنظر، کمی ویسکوز است پس تداخل اجتناب ناپذیر بود (29).
2-7-2 – روشهای رنگ سنجی:
روشی که توسط فووا ابداع شده، خیلی استفاده می شود و بر اساس رنگ حاصل از اتصال ید با پلیمرهای نشاسته می باشد. در گزارشهای مختلف از محققان، اختلاف زیادی در غلظتهای استفاده شده ید ( از 3 میکرومول تا 25/0 میلی مول ) و طول موجهای مورد استفاده ( از 550 تا 700 نانومتر) دیده می شود. چون در این روش حجم نهایی باید به 20 تا 200 میلی لیتر برسد، برای تعداد زیاد نمونه مناسب نیست. بنابراین زیائو و همکارانش بر پایه همین واکنش نشاسته با کلر، روشی را در میکروپلیت ابداع کردند(76).
برنفلد (با استفاده از آمیلوپکتین سیب زمینی بعنوان سوبسترا و یک محلول دی نیتروسالیسیلیک اسید) روشی را برای اندازه گیری آلفاآمیلاز پانکراسی ابداع کرد که در آن فعالیت آنزیم توسط تعداد گروههای کاهنده ایجاد شده توسط آنزیم در طی هیدرولیز سوبسترا تعیین می شد (5). بعد از آن اصلاحاتی روی این روش انجام شد مثلاً کانو سوبسترا را به نشاسته محلول تغییر داد(33).
امروزه دو روش اصلی برای تعیین فعالیت این آنزیمها وجود دارد: یکی بر پایه اندازه گیری مقدار قندهای احیاکننده است که روش “دی نیتروسالیسیلیک اسید” و روش “نلسون – سوموگی” از این جمله اند(50) ، و روش دیگر همان روش “فووا” است (75).
2-8- معماری دمین های ساختار آلفا آمیلاز (Domain):
آلفا آمیلاز شامل تعدادی از دمینهای پروتئینی مجزا است. دمین عملکردی دارای یک ساختار شامل هشت رشته آلفا / بتا در هر بشکه است که شامل سایت فعال ، دمین متصل شونده به کلسیم می باشد(1). چندین آلفا آمیلاز دارای یک دمین صحفه بتا یا beta-sheet domain هستند، که معمولا در پایانه C است (32و31). این دومین به عنوان پنج رشته آنتی پارالل ورقه بتا دسته بندی می شود (42).(شکل2-2)

7