سن و ساکس برای اولین بار در سال 1932 ایده استفاده از نشانگر‌‌‌‌‌های مولکولی را مطرح ساختند. این نشانگر ها در گروه‌‌‌‌‌های مختلفی بر اساس موارد زیر طبقه بندی می شوند: نحوه وراثت (وراثت هسته ای دو والدی، وراثت هسته ای مادری، وراثت مادری اندامک یا وراثت پدری)، نحوه عمل ژن ( بارز و یا هم بارز)، روش آنالیز ( بر اساس هیبریداسیون یا تکنیک PCR) [74].
2-9-2-الف-نشانگر‌‌‌‌‌های بیوشیمیایی6
نشانگر های بیوشیمیایی، پروتئین‌هایی هستند که نتیجه بیان ژن می‌باشند. این پروتئین ها از طریق الکتروفورز و رنگ آمیزی قابل جداسازی و تشخیص می‌باشند. آیزوزایم‌‌‌‌‌ها معمولی ترین نوع نشانگر‌‌‌‌‌های بیوشیمیایی هستــند که از دهـــه 1950تا کنون مورد استـــــفاده قرار می‌گیرند. ایزوزیم‌‌‌‌‌ها تا کنون در بررسی تنوع ژنتیکی و طبقه بندی گیا‌‌‌‌هان به طور گسترد‌‌‌‌ه‌ای مورد استفاده قرار گرفته‌اند. ایزوزیم‌‌‌‌‌ها، تغییرات پلی پپتید‌‌‌‌‌ها رامنطبق بر آلل‌‌‌‌‌های متفاوت در یک مکان ژنی نشان می‌دهند. از مزایایی این دسته از نشانگرها می‌توان به هزینه پایین و سرعت بالای آنها اشاره نمود. از معایب این نوع نشانگر‌‌‌‌‌ها نیز می‌توان به محدود بودن تعداد آن‌‌‌‌ها، تحت تاثیر قرار گرفتن توسط تغییرات پس ازترجمه و مرحله رشدی گیاه اشاره کرد. همچنین در این تکنیک با بررسی یک مکان ژنی فقط بخش کوچکی از تغییرات ژنتیکی واقعی منعکس می شود[58].
2-9-2-ب-نشانگر های DNA
گیا‌‌‌‌هان در چندین سال گذشته بر اساس خصوصیات مورفولوژیکی، ترکیبــات شیمیایی و سیتوژنتیکی طبقه بندی شد‌‌‌‌ه اند. این خصوصیات سهم بزرگی در طبقه بندی گونه‌‌‌‌‌های گیاهی ایفا می‌نمایند. هر چند این روش‌‌‌‌‌ها دارای محدودیت‌‌‌‌‌های از جمله اینکه تحت تاثیر محیط و مراحل نموی گیاه قرار می‌گیرند هستند. در حال حاظر نشانگر‌‌‌‌‌های DNA به طور قابل توجهی در طبقه بندی و اصلاح گیا‌‌‌‌هان مورد استفاده قرار می‌گیرند. بررسی خصوصیات فیلوژنی توسط روش‌‌‌‌‌های مرسوم اصلاحی مشکل می باشد لــذا استفاده از نشانگر‌‌‌‌‌هایDNA در این زمینه بسیار کمک کننده است [85].
نشانگر های وابسته به DNA را می توان به دو دسته کلی غیر مبتنی بر PCR7 و مبتنی بر PCR تقسیم کرد.
1-نشانگر‌‌‌‌‌های غیر مبتنی بر PCR
این دسته از نشانگر‌‌‌‌‌های DNA بدون استفاده از واکنش زنجیر‌‌‌‌ه ای پلیمراز ایجاد می‌شوند. سر گروه این دسته از نشانگر‌‌‌‌ها تفاوت طول قطعات حاصل از هضم توسط آنزیم‌‌‌‌های برشی8 RFLP می‌باشد. RFLP برای اولین بار در 1975 برای شناسایی چند شکلی DNA به منظور نقشه نگاری ژنتیکی یک سروتیپ جهش یافته حساس به دما مورد استفاده قرار گرفت. پس از آن برای نقشه نگاری ژنوم انسان و بعد‌‌‌‌ها به منظور نقشه نگاری ‍ژنوم گیا‌‌‌‌هان مورد استفاده قرار گرفت. در بین نشانگر‌‌‌‌‌های مولکولی مختلف، اولین بار وبر و هلن تجاریز (1989) برای نقشه یابی ژنوم گیاهی از این روش استفاده کردند. در این روش DNA به وسیله آنزیم‌‌‌‌‌های محدود کننده که توالی‌‌‌‌‌های خاصی را در آن تشخیص می دهند هضم می‌شود. DNA بریده شده بر روی ژل آگارز الکترفورز می شود تا قطعات بریده شده بر اساس اندازه از یکدیگر جدا شوند. سپس قطعات تفکیک یافتـه بر روی ژل آگـــارز به غشـــا منتقــل و توســط کاوشگر‌های خاصـــی نشانه گذاری می‌شوند. انگشت نگاری به عنوان نتیجه ای از قطعات چند شکل است که به وسیله کاوشگر به کار برده شده شناسایی می‌شوند. عیب اصلی این تکنیک این است که مقادیر زیادی DNA لازم دارد و به کار بردن تعداد زیاد نمونه را مشکل می‌سازد. به علاوه در این نشانگر فقط یک یا تعداد کمی مکان ژنی ردیابی می‌شود[65].
2- نشانگر‌‌‌‌‌های DNAمبتنی بر PCR
انواع متفاوتی از نشانگر‌‌‌‌‌ها در این دسته وجود دارند که در این جا به اختصار AFLP و RAPD توضیح داده می‌شوند سپس ریز ماهواره ها و نشانگر ISSR به تفضیل معرفی می‌گردند. نشانگر های DNA مبتنی بر PCR برای کاربرد در زمینه اصلاح مولکولی مناسبـتر می‌باشــند چـــون دارای روش کــار ساده و تغییر پذیری آسان می باشند.
RAPD 9
روش‌‌‌‌هایی که در آنها از آغازگر‌‌‌‌‌های اختیاری استفاده می‌شود، در مجموع با عنوان نیمرخ ردیف‌‌‌‌های قابل تکثیر اختیاری چند گانه (MAAP)10نامیده می‌شوند. تکنیک RAPD یکی از سه روش پایه‌ای است که در آن از آغازگر‌‌‌‌‌های اختیاری برای تکثیر قطعه‌‌‌‌‌های DNAالگو استفاده می‌شود. دو روش دیگر، PCR آغازگر اختیاری (AP-PCR)11 و انگشت نگاری با DNA تکثیر شده(DAF)12 نامیده می‌شوند که این روش‌‌‌‌ها از نظر طول آغازگر، شرایط PCR و روش آشکار سازی قطعات DNA تا حدودی باتکنیک RAPD متفاوتند [74]. ویلیامز و همکاران (1990) برای اولین بار این نشانگر را توسعه دادند. این نشانگر مبتنی بر استفاده از یک آغازگر تصادفی و کوتاه می‌باشد که بخش‌‌‌‌‌های تصادفی را در ژنوم تکثیر می‌نماید. از جمله مزایای این نشانگر می توان به استفاده از آغازگر های جهانی و نیاز به مقدار کمی DNA اشاره کرد. همچنین آزمایش به راحتی و با هزینه کم انجام می‌گیرد. اما از معایب آن می توان به عدم تکرارپذیری نتایج اشاره کرد [74]. چندین فاکتور این تکرارپذیری را تحت تاثیر قرار می‌دهند که عبارتند ازغلظت DNA، تکرارپذیری پروفایل ترموسایکلر، کیفیت آغازگر و غلظت آن و مورد دیگر هم DNA پلیمراز می باشد. همچنین از دیگر محدودیت‌‌‌‌‌های آن می توان به انحراف از استثنائات وراثت مندلی (این امر می تواند از ارتباطات پلی ژنیک، باند‌‌‌‌‌های ارگانلی، تغییرات غیر ژنتیکی و تصادفی نتیجه شود) و مشکل دسترسی به همولوژی را نام برد [85].
AFLP 13
زابوو همکاران (1993) این تکنیک را معرفی کردند. ووس و همکاران در 1995 برای اولین از این نشانگر استفاده کردند. در این روش، DNA ابتدا توسط آنزیم‌‌‌‌‌های برشی هضم می‌شود. تکثیر قطعات برش یافته توسط سازشگر الیگونوکلئوتید با تعداد کمی باز صورت می‌گیرد. در این روش تعداد زیادی باند ایجاد که تشخیص چند شکلی را تسهیل می‌کند. تنوع در تعداد قطعات DNA که تکثیر می‌شوند می‌تواند در نتیجه انتخاب تعداد باز و ترکیب نوکلئوتیدی متفاوت در کاوشگر ایجاد شود. تکرار پذیری بالا، تولید سریع و چند شکلی بالا این نشانگر را مناسب برای تشخیص چند شکلی و تعیین پیوستگی برای آنالیز افراد در یک جمعیت در حال تفرق می‌سازد [65].
نشانگر ISSR 14
این روش شامل تکثیر قطعات DNA موجود در فواصل قابل تکثیر بین دو ناحیه تکراری ریز ماهواره‌ای است که در جهت مخالف هم قرار گرفته‌اند. در این تکنیک از ریز ماهواره‌ها به عنوان آغازگر استفاده می‌شود که مکان های مختلفی از ژنوم را مورد هدف قرار داده و نواحی بین توالی های تکراری ساده را در اندازه‌های مختلف تکثیر می‌کند. تکرار های ریز ماهواره ای که به عنوان آغازگر استفاده می‌شوند می‌توانند دی، تری ، تترا یا پنتا نوکلئوتیدی باشند [67]. آغاز گر ها بدون لنگر یا معمولا” لنگری را در انتهای ?5 و یا ?3 از یک تا چهار جفت باز دارا هستند. محصولات PCR در ISSR بین 200 تا 2000 جفت باز طول دارند و قابل جداسازی توسط الکتروفورز با ژل اکریل آمید یا ژل آگارز می‌باشند. تکنیک ISSR ساده و سریع است و تکرارپذیری و چند شکلی بالایی دارد[14].
2-10- توالی های تکرار شونده
ژنوم موجودات عالی شامل سه نوع کپی از توالی‌‌‌‌‌های تکراری ساده می‌باشند.
1- ماهواره‌‌‌‌‌ها15: بخش‌‌‌‌های تکراری بزرگتر از 100 نوکلئوتید هستند که مجموعه‌‌‌‌‌هایی به طول 107-103 نوکلئوتید ایجاد می‌کنند. ماهواره ‌‌‌‌ها در مناطق هتروکروماتینی نزدیک سانترومر‌‌‌‌ها و تلومر‌‌‌‌‌های کروموزومی قرار گرفته‌اند و اندازه آن‌‌‌‌ها در بین جمعیت‌‌‌‌‌ها و افراد داخل یک جمعیت تغییری نمی‌کند [47].
2- ماهوارک‌‌‌‌‌ها16: به بخش‌‌‌‌های تکراری متوسط از 100-10 (معمولا”15-10) نوکلئوتید اطلاق می‌شود که مجموعه‌‌‌‌‌هایی را به طول 105-102 نوکلئوتید تشکیل می‌دهد. ماهوارک ‌‌‌‌ها در مناطق یوکروماتین ژنوم دیده می‌شوند و از نظر اندازه بشدت در بـــین افراد یـــک جمعیت متغییــر می‌باشند [47].
4- ریزماهواره‌‌‌‌‌ها17: بخش های کوچک تکراری دو تا شش نوکلئــوتیدی می‌باشــند کــه در مجموعه هایی به طول تقریبی کمتر از 100 نوکلئوتید سازمان یافته‌اند[55].

2-11-مقایسه انواع مختلف نشانگر ‌‌‌‌های DNA
در حال حاظر انواع متفاوتی از نشانگر ‌‌‌‌های DNA به منظور تجزیه و تحلیل ژنتیکی در دسترس هستند. نشانگر‌‌‌‌های مولکولی مبتنی بر DNA از لحاظ جنبه‌‌‌‌‌های حجم کار و هزینه اولیه در ساخت سیستم نشانگر، هزینه و آسانی اجرای کار، میزان چند شکلی، ماهیت توارث، تعداد آلل‌‌‌‌‌های تجزیه شده در هر ارزیابی، تکرار پذیری و توزیع آن در سطح کروموزوم‌‌‌‌‌ها تفاوت دارند. در جدول 1-1 چند نشانگر مهم از لحاظ برخی خصوصیات با یکدیگر مقایسه شده اند. در این نشانگر‌‌‌‌‌ها ارزیابی چند شکلی در سطح DNA بر پایه ی الگوی برشی و یا تفاوت در طول قطعات تکثیر شده استوار است. به منظور گزینش مناسب لازم است نشانگر‌‌‌‌‌های مختلف از نظر سهولت انجام، قابلیت تکثیر، سرعت ارزیابی و هزینه مورد نیاز مورد مقایسه واقع شوند. از طرف دیگر بسته به هدف مطالعه از جمله ارزیابی تکامل، مطالعه ژنتیک جمعیت، نقشه یابی ژنتیکی، انگشت نگاری DNA و سطح پلوئیدی گونه مورد نظر و سیستم تولید مثل انتخاب نشانگر تحت تاثیر قرار می‌گیرد [10].
جدول 2-1: مقایسه نشانگر ‌‌‌‌های مولکولی مختلف [64و48].
ISSRRFLPRAPDSSRAFLPاصولتکثیر DNA در فاصله بین دو ناحیه تکراری ریز ماهواره هضم آنزیمی

در این سایت فقط تکه هایی از این مطلب با شماره بندی انتهای صفحه درج می شود که ممکن است هنگا