ایههای Talaromyces flavus
1-9- تعریف اصطلاحات
1-9-1-معرفی چهار تیمار برتر متأثر از جدایههای آنتاگونیست با روش کاربردشان جهت بررسیهای مزرعهای
مطابق بررسیهای آزمایشگاهی انجام گرفته از میان 24 جدایهی Talaromyces flavus، سه جدایه مؤثر از قارچ برای آزمایش گلخانهای انتخاب شده بود. همچنین، در آزمایش گلخانهای با تیمارهای اصلی (روشهای مختلف کاربرد جدایههای آنتاگونیست) و تیمارهای فرعی (جدایههای مؤثر انتخاب شده از بررسی آزمایشگاهی)، در نهایت چهار تیمار برتر متأثر از جدایههای آنتاگونیست با روش کاربردشان جهت بررسیهای مزرعهای معرفی گردیدند. بنابراین، در تحقیق حاضر، در نهایت اثرات تیمارهای برتر روی درصد شدت بیماری پژمردگی فوزاریومی گوجه فرنگی مشخص خواهد شد.
این تیمارها با ذکر جدایه و روش کاربرد عبارتند از: 1- TF-To-V-24با روش افزایش به خاک و آغشته سازی بذر، 2- TF-To-V-29 با روش افزایش به خاک و آغشته سازی بذر، 3- TF-To-U-38 با روش افزایش به خاک و آغشته سازی بذر، 4- TF-To-U-38 با روش افزایش به خاک. لازم به ذکر است که کلیهی این جدایهها از جدایههای Talaromyces flavus بوده که از خاک مزارع گوجهفرنگی ورامین (جدایههای TF-To-V-24و TF-To-V-29) و ارومیه (TF-To-U-38) به دست آمدهاند.

1-9-2-تهیه زادمایه قارچهای آنتاگونیست مورد استفاده در مزرعه
برای تهیه زادمایههای مورد استفاده از جدایههای مربوطه، از روش تغییر یافته (نراقی و همکاران، c2010) استفاده میشود. بدین ترتیب که مقداری سبوس برنج به مدت 24 ساعت در آبی با دمای ( 0C35-30) خیسانده شده، سپس بر روی کاغذهای صافی بزرگ گسترانیده و خشک میگردد. در مرحلهی بعد به میزان200 گرم از سبوس برنج و 50 گرم خاک پیت شسته شده در کیسههای سلوفان در اتوکلاو (فشار 1 اتمسفر، حرارت120 درجه سانتیگراد به مدت 15 دقیقه) سترون میگردد. سپس، برای تهیه زادمایه هر یک از جدایهها، سوسپانسیونی محتوی 20 میلی لیتر آب مقطر سترون و چهار قطعه یک سانتیمتری از محیط کشت 10 روزه جدایه مربوطه در کیسههای سلوفان ریخته میشود. برای رشد جدایهها، کیسههای سلوفان در انکوباتور0C 30 به مدت یک ماه و نیم تا دو ماه قرار گرفته و در طی این مدت در صورت مشاهده خشک شدن محتویات، مجدداً 20 میلی لیتر آب مقطر سترون جهت ایجاد رطوبت افزوده میشود. پس از این مدت، محتویات داخل هر یک از کیسههای سلوفان برای خشک شدن بر روی کاغذهای صافی گسترده میشوند تا به عنوان زادمایه مصرفی در گلخانه و مزرعه به دو صورت افزایش به خاک و آغشته سازی بذور مورد استفاده قرار گیرند.

1-9-3-بررسیهای مزرعهای
این بررسی، طی دو سال زراعی متوالی در مزرعهای واقع در ایستگاه تحقیقاتی شاهرود با سابقه آلودگی به بیماری پژمردگی فوزاریومی انجام میگیرد. در هر سال زراعی، آزمایش در قالب بلوکهای کامل تصادفی با پنج تیمار (چهار تیمار با بیش ترین تأثیر روی کاهش بیماری در شرایط گلخانه و شاهد) و چهار تکرار اجرا میگردد. برای هر تکرار، یک کرت شامل 4 ردیف 6 متری و بین هر دو کرت، یک ردیف بدون اعمال تیمار یا نکاشت منظور خواهد شد. در این بررسی از رقم موبیل ( رقم رایج کشت منطقه) استفاده خواهد شد.
در صورتی که کاربرد تیمار متأثر از جدایههای آنتاگونیست، به روش افزایش به خاک باشد، بر اساس مصرف50 کیلوگرم زادمایه قارچ بیولوژیک در هکتار (وان تور و همکاران28، 2002) و 107 CFU/g یا واحد پرگنه ساز در هر گرم از آن اعمال میگردد (روپل و همکاران29، 1983). بدین ترتیب که پس از محاسبه تعداد اسپور جدایه آنتاگونیست در هر گرم از زادمایه مربوطه توسط لام هموسایتومتر و متعادل نمودن آن برای رساندن به تعداد 107 CFU/g از طریق کشت مجدد جدایه آنتاگونیست بر روی بستر زادمایه (در صورت کمتر بودن از تعداد مذکور) و یا افزودن بستر عاری از جدایه آنتاگونیست به زادمایه (در صورت بیشتر بودن از میزان فوق)، میزان مصرفی برای مساحت مورد آزمایش مشخص میشود. به عنوان مثال برای یک تیمار با چهار تکرار به مساحت 500 متر مربع، 5/2 کیلوگرم از زادمایه استفاده خواهد شد. جهت تیمارهایی که کاربرد جدایه آنتاگونیست به صورت آغشته سازی بذور باشد، همانند کاربرد این گونه تیمارها در گلخانه، میزان استفاده از زادمایه تا اندازهای است که کلیه سطوح بذر به آن آغشته گردد (نراقی و همکاران، c2010).
جهت حصول اطمینان از آلودگی لازم برای مزرعه یعنی حداقل در محدوده 103 ×9/0 تا 103 ×345/1 CFU/g یا واحد پرگنهساز در هر گرم خاک (آنجیاه و همکاران30، 2003)، آزمایش تعیین جمعیت قارچ بیماریزا از طریق کشت خاک بر روی محیط کشت اختصاصی کومادا (Komada’s Medium) مطابق روش کومادا31 (1975) انجام میگیرد. در صورت کمتر بودن تعداد واحد پرگنه ساز قارچ بیماریزا در هر گرم خاک مزرعه از میزان فوق، قبل از اجرای آزمایش، زادمایه مصنوعی بر روی بستر ماسه و ذرت به نسبت 20:1 مطابق روش تهیه شده و میزان زادمایه لازم با غلظت103 CFU/g (لیمان و همکاران32، 1996) بر اساس 33 کیلوگرم در هکتار (المر33، 2002) در سراسر خاک مزرعه توزیع شده و تا عمق 15 سانتی متری با آن کاملاً مخلوط میشود (هاشیموتو و همکاران34، 2008).
ارزیابی بیماری پزمردگی فوزاریومی به صورت تعیین شاخص بیماری مطابق روش هائو و همکاران35 (2005) از یک ماه پس از کاشت شروع شده و تا چهار ماه ادامه مییابد (وکوما36، 2008). در نهایت، مقایسه میان تیمارها از طریق تجزیه و تحلیل دادهها توسط آزمون چند دامنهای دانکن و با استفاده از برنامه نرم افزاری MS TAT C صورت میپذیرد.
برای تعیین درصد شدت بیماری (Disease Severity percent) مطابق روش هائو و همکاران37 (2005)، ابتدا میزان وقوع بیماری با استفاده از یک مقیاس شش درجهای (لیو و همکاران38، 1995) به شرح ذیل تعیین میگردد:
صفر= بدون علائم بیماری
1= کلروز برگی و پژمردگی بوته کم تر از 25 درصد
2= کلروز برگی و پژمردگی بوته از 25 تا 50 درصد
3= کلروز برگی و پژمردگی بوته از 51 تا 75 درصد
4- کلروز برگی و پژمردگی بوته از 76 تا 100 درصد
5- بوته مرده یا کاملا از بین رفته

سپس، درصد شدت بیماری برای هر تیمار مطابق فرمول ذیل محاسبه میگردد:

= درصد شدت بیماری × 0 تعداد بوتههای درجه صفر × 1 + تعداد بوتههای درجه یک + ×2 تعداد بوتههای درجه دو + 3 × تعداد بوتههای درجه سه + 4 × تعداد بوتههای درجه چهار 5 + تعداد بوتههای درجه پنج × تعداد کل بوتهها × 5
– میانگین درصد بازدارندگی رشد پرگنه قارچ بیماریزا توسط مکانیسم میکوپارازیتیسم برای هر یک از جدایههای آنتاگونیست مطابق فرمول زیر محاسبه میگردد:
100×قطر رشد پرگنه قارچ بیماریزا در تیمار متاثر از جدایهها ــ قطر رشد پرگنه قارچ بیماری زا در تیمار شاهدقطر رشد پرگنه قارچ بیماریزا در تیمار شاهد